本发明涉及一种同型半胱氨酸浓度的测定方法及同型半胱氨酸诊断试剂盒，利用胱硫醚β合酶与同型半胱氨酸及丝氨酸合成胱硫醚，由胱硫醚β裂解酶酶解胱硫醚，使之再次变回同型半胱氨酸，并产生氨及丙酮酸，使同型半胱氨酸被重复循环利用，并不断地扩增产生氨及丙酮酸；再利用谷氨酸脱氢酶或乳酸脱氢酶分别作用于氨或丙酮酸，使还原型辅酶氧化成为氧化型辅酶，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，进而可以测算同型半胱氨酸浓度的大小。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。